GB/T 23373-2009 食品中抗氧化剂 BHA、BHT 与 TBHQ 的气相色谱测定方法
GB/T 23373-2009 采用 GC-FID 法，以 DB-5（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm）毛细管柱为分离柱，对食品中三种合成抗氧化剂——BHA、BHT 和 TBHQ 进行定性定量分析。方法检出限为 1～2 mg/kg，定量限为 3～6 mg/kg，线性范围 2～200 μg/mL，适用于食用油、油脂食品、油炸食品及含油糕点中抗氧化剂的日常检测和质量监控。
方法原理与适用范围
Section titled “方法原理与适用范围”GB/T 23373-2009 规定的方法原理为：含油食品样品经石油醚在索氏提取器中回流提取，提取液浓缩后经凝胶渗透色谱（GPC）柱净化，去除油脂和色素等大分子干扰物。目标组分在 DB-5 弱极性毛细管柱上按沸点差异分离，氢火焰离子化检测器（FID）检测，外标法定量。
本方法与 ASTM D4294（燃油中硫含量测定）不同，专用干食品基质中极性抗氧化剂的定量分析，其检测灵敏度（1～2 mg/kg）低于 GB 5009.32-2016 中抗氧化剂的液相色谱法（0.1 mg/kg），但操作简便、试剂消耗少、无需昂贵仪器配置，仍是中小型食品实验室的首选方法。
适用范围覆盖以下几类基质：
| 基质类型 | 适用样品示例 | 预期浓度范围 |
|---|---|---|
| 食用植物油 | 大豆油、菜籽油、花生油、橄榄油 | 10～200 mg/kg |
| 含油糕点 | 月饼、酥饼、蛋黄派、桃酥 | 20～400 mg/kg |
| 油炸食品 | 方便面、薯片、油条、炸鸡 | 5～200 mg/kg |
| 动物油脂 | 猪油、牛油、黄油 | 10～300 mg/kg |
| 膨化食品 | 虾条、爆米花、米果 | 10～150 mg/kg |
定量限说明： 方法检出限（MDL）通过空白加标 7 次平行测定按 t 分布计算，BHA 和 BHT 的 MDL 约为 1.0 mg/kg，TBHQ 约 2.0 mg/kg。若样品预期浓度低于定量限，可增加取样量至 5.0 g 并将最终定容体积降至 1.0 mL，将检测灵敏度提升 5 倍。
表 1：行业通用配置（满足标准最低要求）
Section titled “表 1：行业通用配置（满足标准最低要求）”| 组件 | 推荐技术规格 |
|---|---|
| 气相色谱仪 | GC-FID，程序升温稳定性 ±0.1°C，16 阶以上 |
| 色谱柱 | 5% 苯基-95% 二甲基聚硅氧烷，30 m × 0.32 mm × 0.25 μm |
| 进样口 | 分流/不分流，惰性衬管（去活化，内径 4 mm） |
| GPC 净化系统 | S-X3 Bio-Beads 凝胶柱，内径 25 mm × 长度 400 mm |
| 索氏提取器 | 250 mL 平底烧瓶+冷凝管，提取管直径 35～45 mm |
| 浓缩装置 | 旋转蒸发仪（水浴 40°C）或氮吹仪 |
表 2：智恒 GC-2020 气相色谱仪推荐配置（深度优化方案）
Section titled “表 2：智恒 GC-2020 气相色谱仪推荐配置（深度优化方案）”| 组件 | 推荐配置对应能力 | 性能优势 |
|---|---|---|
| 主机 | 智恒 GC-2020 气相色谱仪，EPC 电子压力控制，精度 0.001 psi | 与恒流模式 1.5 mL/min 的载气要求严格匹配，保留时间 RSD＜0.05% |
| 检测器 | FID-2020 型氢火焰离子化检测器，动态范围 10⁷ | 在 BHT（5.5 min）出峰时基线噪声＜0.02 pA，确保 1 mg/kg 定量准确 |
| 进样模块 | 分流/不分流进样口配 4 mm 去活化衬管，0.1 μL 步进 | 不分流模式基线响应＜0.5 s，消除溶剂峰拖尾对 BHT 早出峰的干扰 |
| 色谱柱 | DB-5 弱极性柱 30 m × 0.32 mm × 0.25 μm | 柱效≥120,000 N/m，BHA 与相邻杂质峰分离度＞1.8 |
| 温控系统 | 7 阶 8 段程序升温，速率 0.1～120°C/min | 精准执行 80°C→280°C 升温曲线，中间段温度漂移＜0.05°C |
| 软件工作站 | GC-Solution 色谱工作站，支持 9 点校正曲线 | 外标法自动生成校正因子表，系统适应性报告（理论塔板数、分离度、拖尾因子）一键导出 |
智恒 GC-2020 气相色谱仪在抗氧化剂分析中，其 EPC 流量控制精度确保保留时间 RSD 小于 0.05%，有效提高了 BHA、BHT 与 TBHQ 三峰在复杂油脂基质中的定性和定量可靠性。对于大批量质检任务，配置自动进样器后可实现 24 小时不间断运行，单日处理量可达 80 个以上样品。
| 参数 | 设定值 |
|---|---|
| 色谱柱 | DB-5（5% 苯基-95% 二甲基聚硅氧烷），30 m × 0.32 mm × 0.25 μm |
| 检测器 | FID，280°C |
| 进样口温度 | 250°C |
| 载气 | 高纯氮气（≥99.999%），恒流模式 1.5 mL/min |
| 燃烧气 | 氢气 30 mL/min |
| 助燃气 | 空气 350 mL/min |
| 尾吹气 | 氮气 25 mL/min |
| 进样方式 | 不分流进样，1.0 min 后开分流阀（分流比 50:1） |
| 进样量 | 1.0 μL |
| 阶段 | 起始温度 | 升温速率 | 终止温度 | 保持时间 |
|---|---|---|---|---|
| 初始 | 80°C | — | — | 1 min |
| 升温段 1 | 80°C | 15°C/min | 280°C | — |
| 最终 | 280°C | — | — | 5 min |
| 总运行时间 | 19.3 min |
升温程序以 15°C/min 的速率从 80°C 升至 280°C 的设计基于以下工程考量：起始温度 80°C 略高于石油醚的沸程（60～90°C），确保溶剂峰（戊烷/己烷）在 1～2 min 内完全通过检测器而不干扰 BHT 的早期出峰（约 5.5 min）。15°C/min 的中等等温速率在 BHA（7.0 min）和 TBHQ（9.5 min）间提供足够的有效分离度（Rs＞2.0），同时将总分析周期控制在 20 min 以内。若实验室同时处理大批量样品，可将最终保持时间缩短至 3 min（仅需确认 TBHQ 峰后无残留），单针分析时间可降至 17.3 min。
样品采集与处理
Section titled “样品采集与处理”样品容器与保存
Section titled “样品容器与保存”食用油样品可直接采集于 50 mL 棕色玻璃瓶中，充满不留顶空，密封后置于 4°C 避光保存。固态含油食品（糕点、饼干等）应使用均质袋或广口玻璃瓶盛装，于 4°C 保存不超过 72 h。油炸食品建议在 24 h 内完成提取，以避免油脂氧化导致 BHA/BHT 含量变化。
- 称样： 称取均匀样品 2.0 g（精确至 0.01 g），加入 1 g 无水硫酸钠研磨脱水后装入滤纸筒。
- 索氏提取： 将滤纸筒置于索氏提取器中，加入 100 mL 石油醚（沸程 60～90°C），80°C 水浴回流提取 6～8 h。
- 浓缩： 提取液用旋转蒸发仪在 40°C 水浴中减压浓缩至约 5 mL，转移至 10 mL 试管中。
- GPC 净化： 将浓缩液过 0.45 μm 滤膜后转移至 GPC 进样瓶，S-X3 凝胶柱以环己烷-乙酸乙酯（1:1，V/V）为流动相，流速 1.0 mL/min。弃去前 20 mL 淋洗液（主要含油脂），收集 20～45 mL 馏分（含抗氧化剂）。
- 定容： 收集液在 40°C 氮吹至近干，用正己烷定容至 2.0 mL，过 0.22 μm 微孔滤膜后转入进样瓶待测。
净化后的样液应在 24 h 内完成测定。若需隔夜保存，应密封后置于 4°C 避光冷藏。进样前恢复至室温并振荡混匀 10 s，避免因溶剂挥发导致定容体积变化。仪器进样顺序建议为：溶剂空白 → 标准溶液系列（低浓度至高浓度）→ 样品。每 10 个样品后插入一个中间浓度标准品（10 μg/mL）作为系统适用性检查。
采用外标法定量。以正己烷为溶剂配制混合标准溶液系列，浓度点覆盖 2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL。以峰面积为纵坐标、浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线。三种组分在 2～200 μg/mL 范围内线性关系良好，相关系数 r≥0.999。
标准曲线参数
Section titled “标准曲线参数”| 组分 | 线性范围（μg/mL） | 回归方程 | 相关系数 | 最低定量限（mg/kg） |
|---|---|---|---|---|
| BHT | 2～200 | y = 12.84x + 5.21 | 0.9996 | 3.0 |
| BHA | 2～200 | y = 10.57x + 3.86 | 0.9994 | 3.0 |
| TBHQ | 5～200 | y = 7.93x + 8.42 | 0.9988 | 6.0 |
校正因子（相对于 BHT）
Section titled “校正因子（相对于 BHT）”| 组分 | 相对校正因子（f） | RSD（%，n=7） |
|---|---|---|
| BHT | 1.000（参比） | — |
| BHA | 1.214 | 2.3 |
| TBHQ | 1.619 | 3.1 |
校正因子由各组分标准曲线斜率比计算：fᵢ = k_BHT / kᵢ。当仪器维护（更换进样口衬管、切割色谱柱前端）后应重新测定校正因子，变化＞15% 时需要重新绘制标准曲线。
检出限与定量限
Section titled “检出限与定量限”| 组分 | 检出限 MDL（mg/kg） | 定量限 LOQ（mg/kg） | 测定方法 |
|---|---|---|---|
| BHT | 1.0 | 3.0 | 7 次空白加标 2 mg/kg 按 t₀.₀₁ × SD 计算 |
| BHA | 1.0 | 3.0 | 同上 |
| TBHQ | 2.0 | 6.0 | 7 次空白加标 4 mg/kg 按 t₀.₀₁ × SD 计算 |
若样品检测结果低于定量限（LOQ），报告结果为「＜LOQ」并注明 LOQ 数值。若结果在 LOQ 与 MDL 之间，报告为「检出并注明含量估算值」，并在备注中说明该值仅供参考。
质量控制措施贯穿采样、前处理、仪器分析和数据处理全流程，确保每一个检测结果的真实性和可比性。
| 质控项目 | 执行频率 | 合格标准 | 纠正措施 |
|---|---|---|---|
| 溶剂空白 | 每批次 1 个 | 目标物峰面积＜MDL 对应峰面积的 1/3 | 更换溶剂后重新分析全部该批次样品 |
| 基质加标回收 | 每批次 10% 样品（至少 1 个） | 回收率 80%～120% | 超出范围时排查前处理环节，重做整批样品 |
| 重复测定 | 每批次 10% 样品 | 两次结果 RPD＜15% | RPD 超标时加测第三个平行样 |
| 中间浓度校准品 | 每 10 个样品后插 1 个 | 实测值与理论值偏差＜±10% | 偏差超标时重新校准曲线，回测前 10 个样品 |
| 色谱柱性能检测 | 每日开机后 | BHT 峰理论塔板数≥30,000，拖尾因子 0.9～1.2 | 老化色谱柱（30°C→280°C 以 5°C/min，保持 60 min）或切割柱前段 |
| 样品基质空白 | 首次分析的基质类型 | 无目标物检出 | 如有检出，确认非交叉污染后扣除空白值 |
在 DB-5 色谱柱上，三种抗氧化剂按沸点从低到高依次洗脱。BHT 分子量最小（220.35 g/mol）且极性最弱，最先出峰；BHA 为两种异构体混合物（3-BHA 与 2-BHA），3-BHA 通常在 BHT 之后出现一个主峰，2-BHA 以肩峰形式存在于主峰前沿；TBHQ 极性最强且沸点最高，最后出峰。
出峰顺序与保留时间
Section titled “出峰顺序与保留时间”| 峰号 | 组分 | 简称 | 保留时间（min） | 相对保留时间（α） | 峰型特征 |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 二丁基羟基甲苯 | BHT | 5.5 ± 0.2 | 1.000 | 尖锐对称峰，拖尾因子 0.95～1.10 |
| 2 | 丁基羟基茴香醚 | BHA | 7.0 ± 0.3 | 1.273 | 主峰前缘略带肩峰（2-BHA 异构体） |
| 3 | 叔丁基对苯二酚 | TBHQ | 9.5 ± 0.4 | 1.727 | 峰稍宽，不对称因子 1.10～1.25 |
BHA 与 TBHQ 之间的分离是方法的关键技术指标。两峰在 DB-5 柱上分离度 Rs 通常为 3.0～4.5（基线分离标准 Rs≥1.5）。色谱条件优化时，可优先关注以下参数：升温速率降低至 10°C/min 可额外增加 0.3～0.5 的分离度但总分析时间延长至 25 min；流动相（载气）采用恒压模式（初始柱头压 10 psi）代替恒流模式可改善 BHA 肩峰的分离但线性流速逐渐下降可能导致保留时间漂移。建议实验室首次建立方法时以标准溶液实测分离度，记录在系统适应性报告中。
本方法在以下行业领域具有广泛的应用前景和实际需求：
- 食用油生产质控： 国内食用油抗氧化剂添加量通常为 100～200 mg/kg（以 TBHQ 计），需每批次出厂检验确保添加量合规不超过 GB 2760 规定的 200 mg/kg 上限。
- 膨化食品加工： 马铃薯片、玉米脆等膨化食品含油量 25%～40%，需定期监测 BHT 和 BHA 添加水平，避免因喷涂不均导致局部超标或有效浓度不足。
- 进出口食品检验： 出口至欧盟或日本的含油食品需满足 EU 1333/2008 或日本食品卫生法的抗氧化剂限量标准（BHA 限 200 mg/kg），方法检出限 1 mg/kg 完全满足进口国要求。
- 烘焙糕点质量监控： 月饼、蛋黄酥等高油糕点保质期通常达 60～90 天，添加 BHA/BHT 复配抗氧化剂（1:1 至 1:3 比例）可有效延缓酸败，每批次需监控保持量和降解产物。
- 饲料油脂质量评估： 动物饲料中添加的油脂（如猪油、鸡油）常含 BHT 作为防变质剂，检测结果用于评估饲料保鲜效果和贮存期限。
问：BHT 出峰时间低于 5.0 min 是否正常？
答：BHT 出峰时间受色谱柱柱长和载气流速影响。若保留时间偏低（＜5.0 min），首先检查色谱柱前端是否切割过多（累计超过 20 cm）、柱长有效长度缩短；其次确认载气流速是否因 EPC 压力设定偏差高于设定值。正常范围应在 5.3～5.7 min 之间，偏移超过 ±0.3 min 时应重新记录标准溶液保留时间窗口并更新序列条件。
问：TBHQ 标准曲线低浓度点（2 μg/mL）响应偏低如何处理？
答：TBHQ 的酚羟基在衬管或色谱柱中易发生吸附或氧化，导致低浓度点响应不足。从以下几方面排查：一是更换新去活化衬管并截去色谱柱前端 5～10 cm；二是在标准溶液中添加 0.01% BHT 作为保护剂防止 TBHQ 氧化；三是将进样口温度从 250°C 降至 230°C 减少热降解。如果以上措施后低浓度点仍偏离线性，可考虑将最低浓度点上移至 5 μg/mL 并将线性范围调整为 5～200 μg/mL。
问：对于不含油脂的食品基质该方法的适用性如何？
答：GB/T 23373-2009 的设计目标基质为含油食品（脂肪含量≥5%）。对于低脂基质（如面包、饼干，脂肪含量＜5%），索氏提取效率下降至 60%～70%。此类基质建议改用乙酸乙酯直接超声提取（30 min，功率 200 W）替代索氏提取，提取液经 500 mg PSA 分散固相萃取净化后同样适用本方法的色谱分析条件。需重新验证方法的加标回收率和检出限。